La recherche

LHF ESPOIR a financé des travaux de recherche menés par les équipes de Grégoire Michaux à l’Université de Rennes qui avaient pour but de tester l’effet d’un traitement au LPA (Acide Lysophosphatidique) sur les défauts cellulaires induits par la mutation du gène MUNC18-2. La synthèse du projet et les résultats sont présentés ci-dessous : Equipe : Anne Bourdais, Ophélie Nicolle, Aurélien Bidaud-Meynard, Grégoire Michaux Univ Rennes, CNRS, IGDR (Institut de Génétique et Développement de Rennes) – UMR6290, F-35000 Rennes, France Contexte de l’étude : MUNC18-2 est l’un des gènes responsables de la Lymphohistiocytose Familiale de type 5 (FHL5). Plus précisément, il a été démontré que la protéine MUNC18-2 codée par le gène STXBP2 entraîne des troubles digestifs aux enfants portant cette mutation génétique. MUNC18-2 intervient dans la formation du pôle apical des cellules épithéliales, c’est-à-dire les cellules qui bordent la surface (externe) du corps et des organes. En conditions normales, ce gène permet la formation de la surface d’échange de l’épithélium de l’intestin, appelée bordure en brosse qui permet l’absorption des aliments. C’est dans la bordure en brosse que sont insérés plusieurs transporteurs nécessaires à l’absorption des aliments et à la régulation des mouvements d’eau et d’électrolytes entre le tube digestif et le reste du corps. Une mutation du gène MUNC18-2 entraînerait donc, chez le patient porteur, une malabsorption des nutriments et des diarrhées chroniques. Ce patient dépend alors d’une nutrition parentérale toute sa vie (la nutrition parentérale est une méthode médicale qui consiste à apporter des éléments nutritifs par voie intraveineuse directement dans le sang). Lien avec le gène MYO5B Ces défauts structuraux et fonctionnels de la bordure en brosse sont également retrouvés chez des patients atteints par la maladie des inclusions microvillositaires (MVID). Un des gènes majeurs impliqués dans cette pathologie est le gène MYO5B. MYO5B code une protéine de type moteur moléculaire qui sert au transport des vésicules vers la bordure en brosse des cellules intestinales. Les vésicules s’accumulent sous cette membrane quand le gène MYO5B est muté. Les protéines MYO5B et MUNC18-2 sont ainsi impliquées dans une même voie de trafic intracellulaire, ce qui explique les similitudes entre les symptômes observés dans la MVID et la LHF au niveau intestinal (Dhekne et al., Human mutation 2018). L’effet du LPA Récemment, Kaji et al. [Gastroenterology 2020] ont montré que l’acide lysophosphatidique (ou LPA) permet de restaurer partiellement la bordure en brosse des cellules intestinales chez la souris déficiente pour la protéine Myo5b (qu’on appelle Myo5b-KO), et également dans le modèle organoïde intestinal Myo5b-KO. Les modèles organoïdes intestinaux sont des mini-reproductions de l’intestin humain ou de souris cultivées en laboratoire, utilisées pour étudier le fonctionnement et les maladies intestinales. En effet, après traitement au LPA, la taille des microvillosités est augmentée et la localisation apicale de marqueurs de la bordure en brosse (tels que le co-transporteur Na+/Glucose SGLT1, le transporteur Na+/H+ NHE3 ou encore l’enzyme de dégradation DPPIV) est partiellement restaurée. Figure 1 : Des souris Myo5b KO ont reçu un traitement au LPA par injection intra-péritonéale (ip) ou par gavage (og). On observe un retour du transporteur NHE3 à la membrane après traitement (ogLPA, ipLPA), signe d’une amélioration du trafic et du transport des vésicules à la membrane apicale de la cellule. [Kaji et al., 2020] Les hypothèses du projet de recherche Les recherches menées par les équipes de Grégoire Michaux à l’Université de Rennes avaient pour but de tester l’effet d’un traitement au LPA sur des organoïdes murins déficients pour Munc18-2, et de déterminer s’ils arrivent à corriger certains défauts de structure. Pour cela, les chercheurs ont utilisé deux types d’organoïdes intestinaux : Dans chaque lignée, ces déficiences entrainent la présence de défauts de structure et de fonction dans la bordure en brosse des organoïdes. Résultats : 1/ Après avoir injecté du LPA à une concentration importante pendant 48 heures, au cours de la différenciation des organoïdes (c’est à dire au moment où la bordure en brosse se forme et se différencie du reste de l’intestin), les chercheurs ont observé la formation d’inclusions microvillositaires (MVI) et les ont quantifiées. On peut en conclure que le LPA n’empêche pas la formation de MVI dans des organoïdes Munc18-2 KO. 2/ En parallèle, des observations en microscopie électronique à transmission (MET) ont été faites afin d’étudier l’effet du LPA sur la bordure en brosse et sur le trafic apical. 3/ N’ayant pas observé d’effet à une concentration de 5 μM pendant 48h, les chercheurs ont ensuite testé différentes concentrations de LPA (5 μM, 10 μM, 25 μM) sur la lignée Myo5b et différents temps de traitement (48h, 72h) afin de tenter d’optimiser une potentielle correction des défauts cellulaires. Une analyse de la localisation du transporteur NHE3 a ensuite été réalisée. Après analyse des images, le traitement à une concentration de 5μM pendant 72h a été choisi pour les manipulations. Finalement, les chercheurs n’observent pas d’augmentation significative du ratio apical/subapical, ni du ratio apical/cytoplasmique du marqueur NHE3 après traitement au LPA. Il n’y a donc pas d’amélioration du trafic apical dans les organoïdes Myo5b KO et Munc18-2 KO en réponse au LPA. Conclusion/Perspectives : Suite aux expérimentations réalisées, les chercheurs n’ont pas pu reproduire les résultats publiés par Kaji et al. sur les phénotypes MVID des organoïdes déficients pour Myo5b et n’ont pas pu mettre en évidence un effet correctif du LPA dans le génotype Munc18-2 KO. Cette différence de résultats pourrait s’expliquer par la méthode de culture des organoïdes, qui diffère légèrement par rapport à celle des expériences de Kaji et qui ne leur a peut-être pas permis de déterminer la fenêtre d’action du LPA. Il faut quand même noter que, d’après les résultats publiés, l’effet thérapeutique potentiel du LPA semble minime au vu de la non prise de poids des souris déficientes pour Myo5b après traitement. A l’avenir, d’autres voies de traitement sur le modèle organoïde pourront être testées afin de s’assurer que les molécules atteignent bien leur cible. Une fois ces techniques maîtrisées au sein du laboratoire, l’objectif sera de tester de nouveaux traitements pour induire la repousse des microvillosités composant la

La Fondation Groupama a apporté son soutien à une équipe de l’Institut Imagine, en partenariat avec l’association LHF Espoir, afin de faire avancer la recherche sur cette maladie génétique très rare qui touche essentiellement des jeunes enfants. Rencontre avec… Geneviève de Saint Basile, Directrice de recherche émérite à l’INSERM. Fernando Sepulveda, Directeur de recherche au CNRS. Propos recueillis par Shemine Asmina, Présidente de l’association LHF Espoir. Votre équipe mène des recherches sur la LHF depuis plus de 20 ans. En quoi consiste cette maladie ? La Lymphohistiocytose familiale (LHF) est une maladie génétique rare mais très sévère qui se manifeste par une réponse immunitaire exagérée et altérée. Chez les patients, lorsqu’un virus entre dans l’organisme, les lymphocytes T qui ont pour rôle de tuer les cellules infectées par un virus, n’assurent plus correctement cette fonction de défense. La maladie se caractérise alors par une fièvre persistante, une fatigue et une irritabilité, accompagnées d’une augmentation de volume du foie et de la rate, et parfois de troubles neurologiques qui peuvent apparaître tout de suite ou dans un deuxième temps. Biologiquement, la maladie se caractérise par une diminution du nombre de cellules dans le sang, des anomalies au niveau du foie et une inflammation persistante. Beaucoup des causes génétiques identifiées, en particulier par notre équipe, affectent des gènes dont la fonction est nécessaire à l’activité cytotoxique des lymphocytes. Cette fonction est utilisée pour tuer dans l’organisme, les cellules infectées (virus/bactéries). D’autres causes de LHF indépendante de la fonction cytotoxique existent. L’association LHF Espoir et la Fondation Groupama soutiennent votre équipe pour un projet de recherche. En quoi consiste-t-il ? Le projet que nous menons vise à mieux caractériser les causes et des mécanismes à l’origine de ces autres formes de LHF (indépendantes de la fonction cytotoxique). Nous avons pour cela mené plusieurs travaux de recherche : Comment expliquez-vous le lien entre la molécule TIM-3 et la LHF ? Nous avons récemment montré que TIM-3 était une cause de LHF indépendante de la cytotoxicité. TIM-3 est aussi une molécule ciblée en immunothérapie des cancers. Nous avons développé un modèle expérimental chez la souris pour mieux comprendre comment des anomalies génétiques de TIM-3 pouvaient conduire à une LHF. Nous avons obtenu une lignée de souris portant la même anomalie génétique dans TIM-3 que celle identifiée chez les patients développant une LHF. Puis nous avons défini des conditions expérimentales qui permettent de reproduire chez ces souris génétiquement modifiées la pathologie humaine. Afin de mieux cibler les cellules du sang jouant un rôle prépondérant dans la pathologie, nous avons comparé l’expression différentielle des gènes de cellules de patients et celles de sujets contrôle. Les premiers résultats suggèrent un rôle important joué par les cellules de types monocytaires. En quoi vos travaux de recherche permettent-ils d’identifier de nouvelles causes génétiques ? Nous avons déjà identifié que la LHF est causée par des mutations dans quatre gènes qui régulent la cytotoxicité : Munc 13-4, Perforine, Munc 18-2 et Syntaxine 11. Un des objectifs du projet que nous venons de terminer était d’évaluer l’étendue de la variabilité de l’expression de la maladie chez les patients et de la corréler avec le type de mutation identifiée. Une première étude, soutenue en particulier par LHF Espoir, nous avait permis d’identifier chez quelques patients adultes présentant une pathologie inflammatoire strictement neurologique, des mutations dans les gènes régulant la cytotoxicité. Au cours de ce projet, nous avons pu recruter plus de 50 sujets adultes présentant une pathologie essentiellement neurologique et identifier, dans plus de 20% des cas, des mutations dans le gène de la perforine. Nous avons montré que ces mutations diminuent en partie l’expression de la perforine dans les lymphocytes. D’autre part, la recherche d’autres causes génétiques est en cours chez sept nouveaux patients par une approche de séquençage haut débit. Quel impact le soutien de l’association LHF Espoir et de la Fondation Groupama a-t-il eu sur les travaux de votre équipe ? Ce soutien de l’association LHF Espoir et de la Fondation Groupama a eu un effet levier pour le financement de la suite du projet « LHF et TIM-3 » qui a été attribué par l’Agence National pour la Recherche (ANR).

Avec le soutien de LHF Espoir, les équipes de Grégoire Michaux et de Nadine Cerf-Bensussan vont mener un projet de recherche de la mutation du gène STXBP2 (qui code pour la protéine Munc 18-2) en étroite collaboration. Pour rappel, cette mutation génétique est liée à la maladie de Lymphohistiocytose Familiale (LHF) et entraîne une malabsorption intestinale. Grégoire Michaux est directeur de recherche en biologie du développement, à l’Institut de Génétique et Développement de Rennes (CNRS). Nadine Cerf-Bensussan est directrice de recherche à l’Inserm et responsable du laboratoire Immunité Intestinale à l’institut Imagine. Malabsorption digestive et mutation génétique STXBP2 (Munc 18-2) 1- Pouvez-vous rappeler quelles sont les principales fonctions de l’intestin ? N. Cerf-Bensussan : L’intestin est l’organe qui permet la digestion et l’absorption des nutriments. C’est aussi une barrière qui permet de protéger l’organisme contre les très nombreux microbes et allergènes alimentaires présents dans sa lumière. 2- Pouvez-vous expliquer le mécanisme d’absorption de l’intestin ? N. Cerf-Bensussan : Il s’agit d’un processus complexe à travers lequel les nutriments provenant de la digestion des aliments dans la lumière de l’intestin sont transportés dans le sang ou la lymphe pour être mis à la disposition des différents tissus de l’organisme et permettre leur fonctionnement. L’absorption des nutriments a lieu dans la partie proximale de l’intestin (ou intestin grêle). La réabsorption de l’eau, qui est importante pour éviter les diarrhées, a lieu principalement dans la partie distale de l’intestin (ou côlon). 3- Quel rôle jouent les cellules épithéliales dans ce mécanisme d’absorption ? N. Cerf-Bensussan : Les cellules épithéliales forment une monocouche à la surface de l’intestin. Ce sont elles qui entrent les premières en contact avec les nutriments, l’eau et les minéraux mais aussi les multiples microbes présents dans la lumière de l’intestin. Leur pôle apical est spécialisé pour favoriser l’entrée des nutriments et réguler de façon précise les flux d’eau et d’électrolytes. Ce pôle présente une « bordure en brosse» faite de multiples replis de la membrane qui borne chaque cellule. Ces replis appelés microvillosités permettent d’augmenter de façon importante l’efficacité de l’absorption. En effet, ces replis/microvillosités contiennent des transporteurs spécialisés dans l’entrée des différents nutriments ainsi que des «pompes» qui régulent les mouvements d’eau et d’électrolytes (sodium, potassium, chlore…). Une fois entrés dans les cellules épithéliales, les nutriments peuvent être transportés au pôle basal des cellules épithéliales et pénétrer ensuite dans le sang, à travers les nombreux vaisseaux sanguins et lymphatiques présents dans le tissu de soutien sur lequel reposent les cellules épithéliales. (Les cellules épithéliales sont reliées entre elles par des dispositifs de jonction qui forment un ciment assurant l’étanchéité de la monocouche et limitant l’entrée des microbes. Ces jonctions participent aussi à la régulation des mouvements d’eau et d’électrolytes.) 4- En quoi la mutation du gène STXBP2 (liée à la protéine Munc 18-2) affecte-t-elle ce mécanisme d’absorption ? N. Cerf-Bensussan : STXPB2 est le gène qui code pour la protéine Munc 18-2. La mutation de STXPB2 empêche le ciblage des molécules nécessaires à la formation du pôle apical des cellules épithéliales. Elle gêne ainsi la formation de la bordure en brosse et l’insertion dans cette bordure de plusieurs des transporteurs et des « pompes » nécessaires à l’absorption des nutriments et la régulation des mouvements d’eau et d’électrolytes. Les altérations de la bordure en brosse dépourvue de certains transporteurs et des pompes expliquent la diarrhée intraitable et la malabsorption sévère induites par les mutations génétique STXPB2 liées à la maladie de LHF. Travaux de recherche sur les mutations génétiques entraînant une malabsorption digestive 5- Quelles sont les autres maladies qui présentent un déficit d’absorption ? En quoi sont-elles similaires ou différentes de la mutation génétique STXBP2 (Munc 18-2) ? N. Cerf-Bensussan et G. Michaux : Il existe de très nombreuses maladies pouvant conduire à un défaut d’absorption. C’est le cas notamment : Certaines mutations affectent de façon profonde la différenciation des cellules épithéliales et provoquent des défauts d’absorption sévères et difficilement traitables. 6- Quel traitement existe-t-il aujourd’hui pour pallier à la malabsorption intestinale liée aux maladies génétiques qui affectent la différenciation des cellules épithéliales et de leur bordure en brosse (STXBP2, Myo5B, STX3..) ? N. Cerf-Bensussan et G. Michaux : Les solutions thérapeutiques sont très limitées et peu satisfaisantes. La première est la nutrition parentérale qui consiste à utiliser la voie intraveineuse pour compenser les pertes en eau et en électrolytes (souvent massives) et apporter les nutriments qui ne peuvent être absorbés. Cette solution, indispensable à la survie des patients, est très contraignante et peut présenter des incompatibilités avec une vie normale. Elle est compliquée sur le long terme, en raison du risque infectieux et des difficultés pour conserver des veines accessibles aux perfusions. Ces difficultés ont conduit à développer la transplantation intestinale pour remplacer l’intestin malade par celui d’un donneur. Cette transplantation reste à ce jour très difficile, notamment en raison de la fréquence des rejets liée à la présence d’un système immunitaire très abondant dans l’intestin. Des travaux de recherche sont en cours pour tenter la correction des mutations par des approches pharmacologiques (ou molécules médicaments). C’est notamment l’objectif des travaux de recherche qui sont réalisés sur le gène STXBP2. D’autres approches de long terme visent à la correction du défaut génétique dans les cellules épithéliales et à l’utilisation de ces cellules corrigées pour reconstruire l’intestin. 7- Comment la recherche a permis de mieux comprendre et définir les anomalies entraînant un déficit d’absorption au niveau du système digestif ? N. Cerf-Bensussan et G. Michaux : Les travaux fondamentaux sur les mécanismes contrôlant la différenciation des cellules épithéliales et l’absorption des nutriments ont représenté une base essentielle pour comprendre les conséquences des mutations. Réciproquement, l’analyse des conséquences des mutations sur la différentiation et le fonctionnement des cellules épithéliales apportent de nouvelles informations sur le rôle des molécules concernées par les mutations. Ces travaux permettent de mieux cerner les options thérapeutiques et de mettre en place des outils pour identifier des cibles thérapeutiques : Projet de recherche sur Munc 18-2 8- Pouvez-vous expliquer quand et comment la

Geneviève de Saint-Basile est directrice de recherche à l’INSERM au sein de l’unité 1163-Institut Imagine « Développement normal et pathologique du système immunitaire » et Praticien Hospitalier attaché au centre d’étude des déficits immunitaires de l’Hôpital Necker-Enfants Malades à Paris. Un des axes principaux de sa recherche vise l’étude des syndromes hémophagocytaires, tels que la lymphohistiocytose familiale. En 2011, elle a reçu le Prix Recherche de l’INSERM grâce à ses découvertes sur le système immunitaire qui relient recherche clinique et fondamentale. Description de la maladie Pouvez-vous expliquer brièvement en quoi consiste la maladie connue sous le nom de lymphohistiocytose familiale ? G. de Saint-Basile : La LHF est une maladie génétique rare qui se caractérise par une réponse exagérée et altérée du système immunitaire. Chez les patients, lorsqu’un virus entre dans l’organisme, les lymphocytes T qui ont pour rôle de tuer les cellules infectées par un virus, n’assurent plus correctement cette fonction de défense. La maladie se caractérise alors par une fièvre persistante, une fatigue et une irritabilité, accompagnées d’une augmentation de volume du foie et de la rate, et parfois de troubles neurologiques qui peuvent apparaître tout de suite ou dans un deuxième temps. Biologiquement, la maladie se caractérise par une diminution du nombre de cellules dans le sang, des anomalies au niveau du foie et une inflammation persistante. Pouvez-vous expliquer plus en détails le syndrome d’activation macrophagique lié à cette maladie et expliquer quelles conséquences il peut avoir sur le patient ? G. de Saint-Basile : Le syndrome d’activation macrophagique (SAM) observé dans la lymphohistiocytose familiale apparaît souvent à quelques mois de vie, voir dès la naissance ou parfois plus tardivement pendant l’enfance. Quelques rares cas adultes ont également été observés. Le SAM va généralement se déclencher suite à une infection souvent virale. Il se caractérise par une activation et une multiplication importante des lymphocytes T, qui répondent de façon exagérée mais peu efficace à l’infection, et qui vont secondairement activer les macrophages. Les lymphocytes et les macrophages activés vont alors s’infiltrer dans les différents organes (foie, rate, moelle osseuse, système nerveux….) et les endommager gravement. Combien de patients sont concernés par cette maladie ? La maladie peut-elle provoquer un décès? Quelles en sont les principales causes ? G. de Saint-Basile : Comme indiqué plus haut, le syndrome d’activation macrophagique provoque une inflammation importante au niveau des différents organes, entraînant leur destruction et le décès du patient en l’absence de traitement. Le traitement par greffe de moelle osseuse nécessitant préalablement une chimiothérapie, cette dernière peut être associée à une toxicité importante conduisant à un décès dans 20% des cas. A-t-on une idée du nombre de décès provoqué par la maladie chaque année ? G. de Saint-Basile : Environ 20 à 30 % des cas. La recherche Pouvez-vous expliquer plus en détails le rôle et les missions de l’institut Imagine ? G. de Saint-Basile : L’institut Imagine est un lieu unique où ont été rassemblés à la fois des chercheurs et des médecins parmi les meilleurs, qui possèdent des compétences diverses, pour comprendre et guérir les maladies génétiques. La force de cet Institut repose sur les nombreuses synergies qui existent entre la recherche et la médecine tout au long du processus, mais aussi l’intégration du patient au sein de la réflexion scientifique et médicale. L’objectif est d’aller aussi rapidement que possible vers la compréhension des mécanismes des différentes maladies génétiques et offrir au plus vite des solutions vers de nouveaux traitements. Depuis quand votre équipe de recherche travaille-t-elle sur la maladie de lymphohistiocytose familiale ? G. de Saint-Basile : Nous avons débuté notre recherche sur la lymphohistiocytose familiale dans les années 1997, il y a donc plus de vingt ans. Pourquoi avez-vous décidé de travailler sur cette maladie ? G. de Saint-Basile : À cette époque, la LHF qui avait été décrite pour la première fois en 1952, était très mal comprise et plutôt considérée comme une pathologie cancéreuse. Cependant, le caractère « familial » de la lymphohistiocytose, indiquait qu’il s’agissait d’une maladie génétique dont le(s) gène(s) restai(en)t à identifier et les mécanismes de la maladie à mieux comprendre. Un certain nombre de patients atteints de cette maladie avait pu être diagnostiqué et était suivi dans le service d’Immunologie de l’Hôpital Necker Enfants Malades. Nous avons pu développer dans le laboratoire les outils nécessaires afin de mieux comprendre la composante génétique, puis fonctionnelle de la maladie. Quelles ont été les avancées les plus importantes sur cette maladie au cours des années ? De quand datent-elles ? G. de Saint-Basile : L’avancée la plus importante a certainement été lorsque nous avons pu identifier le premier gène responsable de la lymphohistiocytose familiale : il s’agit du gène qui code pour la protéine appelée perforine. Pour rappel, chaque gène code pour une protéine qui assure une fonction biologique. La perforine, qui est secrétée par les lymphocytes T, a pour fonction de créer des pores (trous) dans la membrane des cellules cibles (une cellule infectée par un virus par exemple). Avec la perforine, les lymphocytes T secrètent des enzymes qui vont pénétrer dans les cellules cibles par les pores (trous) et les tuer (c’est l’activité cytotoxique des lymphocytes). Cette découverte permettait de démontrer que l’inflammation qui caractérisait la LHF était liée à une anomalie de l’activité cytotoxique des lymphocytes. Ce travail a été publié en 1999. La caractérisation de ce premier gène nous a ensuite incité à rechercher d’autres gènes impliqués dans la LHF, chez les patients pour lesquels nous ne trouvions pas de mutations liées à la perforine. Nous avons, avec d’autre groupes, identifié des mutations dans de nouveaux gènes responsables de la LHF qui affectent également l’activité cytotoxique des lymphocytes: Dans le cas de mutations dans le gène Munc18-2, il existe souvent des symptômes digestifs associés à la maladie (en plus des symptômes immunitaires), la protéine Munc18-2 jouant un rôle important au niveau des cellules de l’intestin, qu’il reste à mieux caractériser. Aujourd’hui on compte 25 patients en France touchés par ce défaut génétique (sur les 250 diagnostiqués avec la